转染survivin反义mRNA对Jurkat淋巴瘤细胞生长和化疗敏感性的影响

目的 研究转染survivin反义mRNA对Jurkat淋巴瘤细胞生长的影响以及转染后淋巴瘤细胞对化疗药物的敏感性。方法 构建survivin反义mRNA真核表达质粒pcDNA3．1-反义（As）survivin;利用脂质体转染法将其转入高表达survivin mRNA T淋巴母细胞淋巴瘤Jurkat细胞系,用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）、免疫组织化学SP法、Western印迹法检测细胞中survivin表达;用细胞计数、流式细胞术（FCM）检测其细胞生长曲线、细胞凋亡指数,并进行光镜、电镜形态学观察;并对转染pcDNA3．1-Assurvivin前后Jurkat细胞分别加入4-羟基-环磷酰胺（CTX）、甲氨蝶呤（MTX）72h后,常规MTT检测细胞存活率。结果 RT—PCR检测转染pcDNA3．1-Assurvivin后48h、5和6周Jurkat细胞survivin mRNA表达,发现survivin mRNA表达皆低于对照组;转染后survivin蛋白表达也明显降低。转染pcDNA3．1-Assurvivin后Jurkat细胞生长倍增时间（52h）明显延长;用FCM检测细胞凋亡发现,转染pcDNA3．1-Assurvivin后Jurkat细胞凋亡指数[20．2％（48h）]明显高于对照组（转染空质粒和未转染组,2．1％和1．3％）;5和6周为6．2％和6．8％,明显高于未转染细胞（1．3％和1．0％）。光镜、电镜观察见转染细胞出现较多凋亡细胞及一些变性肿胀细胞;MTT检测结果显示Jurkat细胞转染前后,经化疗药物4-羟基-环磷酰胺和甲氨蝶呤作用,转染细胞的抑制率明显大于未转染组,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论 survivin基因对Jurkat细胞系的生长起着重要的作用,抑制survivin基因表达在T淋巴母细胞淋巴瘤治疗中可能有重要的意义,该基因似可能作为治疗的靶点。     

肺癌患者血清单核细胞趋化蛋白-1含量和活性的变化及其意义

目的 探讨肺癌患者血清单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)含量和单核细胞趋化活性(MCA)的变化规律.方法 采用ELISA测定肺癌组和健康对照组血清MCP-1的含量,并以Boyden小室趋化实验测定两组血清MCA.结果 肺癌组血清MCP-1含量明显高于健康对照组(P<0.01),但肺癌组血清MCA却明显低于健康对照组(P<0.01).肺癌组血清MCP-1含量与MCA的相关系数(r=0.39)明显低于健康对照组(r=0.87).结论 肺癌患者存在单核细胞趋化活性不足.     

肺癌A549耐药裸鼠移植瘤模型的建立

目的探讨肺癌A549耐药裸鼠移植瘤模型的建立方法,为克服肿瘤多药耐药新药的筛选提供体内研究的模型。为进行肿瘤的体内相关研究和抗癌药物的筛选提供实验基础。方法使用顺铂诱导肺癌A549细胞,以建立其多药耐药细胞株A549/DDP;MTT细胞毒实验检测细胞对顺铂的敏感性;皮下接种法建立裸鼠移植瘤模型;绘制移植瘤生长曲线,观察其增值特性。结果经过8个月的诱导建立了肺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP;MTT细胞毒实验结果显示与A549细胞比较,A549/DDP细胞对顺铂约耐药8倍,并且A549/DDP耐药细胞建立的裸鼠移植瘤仍然保持对顺铂的耐药性;生长曲线结果显示A549/DDP细胞裸鼠移植瘤的增殖速度与A549细胞之间没有显著性差异。结论成功建立了肺癌A549/DDP耐药细胞裸鼠移植瘤模型,可为肺癌耐药的研究提供较理想的动物模型。     

免疫组化Envision法CD34染色在不同病变胃粘膜、组织中价值研究

目的探讨用免疫组化Envision法显示CD34在不同病变胃粘膜组织中的价值研究。方法 取临床病理标本,分慢性胃炎56例、慢性萎缩性胃炎50例、肠化生59例、不典型增生61例;无淋巴结转移胃癌组织55例,有淋巴结转移胃癌组织57例。用免疫组织化学Envision法显示各组CD34表达情况,用高倍显微镜观察微血管形态结构并测量微血管密度。结果显微镜下CD34染色阳性呈棕黄色,背景清晰;常表现为分支状、窦隙状、芽孢状、椭圆形、圆形及不规则形等。不同病变胃粘膜组织CD34表现不一,按微血管密度计算:慢性胃炎组为13.17±10.12;慢性萎缩性胃炎组为11.32±7.20;肠化生组为13.19±8.77;不典型增生组为16.58±10.49;无淋巴转移胃癌组为26.72±10.84;有淋巴转移胃癌组为27.69±10.21。微血管密度(MVD)在慢性胃炎组、萎缩性胃炎组、肠化生组组间无差异(>0.05);萎缩性胃炎组、肠化生组、不典型增生组组间无差异(>0.05);慢性胃炎组与不典型增生组有差异(<0.05);慢性胃炎、萎缩性胃炎、肠化生、不典型增生各组与无淋巴转移胃癌组织、有淋巴转移胃癌组织组组间均有显著差异(...     

舟山眼镜蛇细胞毒素1对K562细胞的抑制作用

目的: 研究舟山眼镜蛇细胞毒素1(CTX1)对人慢性粒细胞白血病细胞系K562的抑制作用。方法: 应用MTS方法和细胞计数法分别检测不同浓度CTX1作用K562后的细胞相对活力和细胞数;PI染色后用倒置荧光显微镜观察活细胞培养体系中K562细胞死亡情况;流式细胞术检测Annexin V-FITC和PI双染色后细胞凋亡情况。结果: 不同浓度的CTX1(2、5、10 mg/L)作用于K562细胞24 h,细胞相对活力分别为(90.50±3.07)%、(58.33±3.08)%和(27.43±1.99)%(与阴性对照组相比,下同,P<0.05),作用24 h时CTX1对K562细胞的半数抑制浓度为5.77 mg/L。CTX1(8 mg/L)作用于K562 6 h、12 h、24 h,细胞数分别占对照组的(85.01±3.54)%、(56.65±3.59)%和(43.24±4.15)%,P<0.05。随CTX1浓度增加和作用时间延长,荧光显微镜下观察到被PI染色的细胞数逐渐增多。CTX1(8 mg/L)作用于K562细胞6 h、12 h、24 h,细胞坏死率分别为(0.73±0.06)%、(13.90±0.46)%和(23.33±0.86)%;晚期凋亡率分别为(16.27±0.21)%、(26.90±1.23)%和(18.77±0.81)%。结论: CTX1对K562细胞有明显抑制作用,主要引起K562细胞晚期凋亡和坏死。     

人参总皂苷对黑色素瘤自杀基因治疗的增效作用

[目的]观察人参总皂苷联合自杀基因HSV-tk/GCV治疗系统对小鼠黑色素瘤的生长抑制效应,探讨人参总皂苷对黑色素瘤自杀基因治疗的增效作用.[方法]选用85只C57BL/6J雄性小鼠,除正常组5只外其他均接种含20%B16tk+细胞的tk+和tk-混合细胞,造模成功后随机分为模型组、人参总皂苷组、tk/GCV组、人参总...     

液相芯片技术一步反应法联合定量测定人血清CEA、AFP和tPSA

目的 建立用液相芯片技术同时定量测定人血清中癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)和总前列腺特异性抗原(tPSA)水平的一步反应法,并对该方法进行评价.方法 制备抗体交联微球及生物素标记抗体,用双抗体夹心法测定临床血清标本.结果 联合测定CEA、AFP和tPSA的线性范围分别为0.063～200 ng/ml、0.052～66.6 ng/ml、0.016～20 ng/ml;最低检测限分别为31.3 pg/ml、26.0 pg/ml、7.8 pg/ml;批内精密度<10 %,批间精密度<14 %;血清标本CEA、AFP和tPSA检测值与化学发光免疫分析法(CLIA)测值的相关系数为0.920～0.940,与液相芯片两步反应法测值的相关系数为0.952～0.979.该方法仅需1 μl标本,2 h即可完成检测.结论 液相芯片一步反应法具有高通量、检测范围广、灵敏度高、重复性好、节省样品和时间等优点,具有较大临床应用潜力.     

彗星试验检测大鼠死后肾脏细胞DNA含量与死亡时间的关系

 【目的】 探讨特定条件下,利用彗星试验测定SD大鼠死后6 ~ 48 h肾脏细胞DNA含量与死亡时间的关系&#65377;【方法】 健康成年雌性SD大鼠,按取材时间随机分为6组,每组3只&#65377;颈椎脱臼法处死动物,置于25.1 ℃(广州地区近5年10月份平均气温)培养箱中,分别于0&#65380;6&#65380;12&#65380;24&#65380;36&#65380;48&#65380;60 h取大鼠肾脏组织,制备单细胞悬液,进行彗星试验,荧光显微成像系统采集图像,采集相关参数(Comet 4.0)并进行Kruskal-Wallis检验&#65377; 【结果】 死后6 ~ 48 h, SD大鼠肾脏细胞DNA碎片随死亡时间延长而增加,尾长在死后各时间点依次呈明显的增长趋势,Oliver尾矩和尾DNA随死亡时间的延长,亦有一定的增长趋势,60 h未能测出&#65377;Kruskal-Wallis检验显示:各时间点彗星尾长均数的差异有高度显著性(P < 0.01);彗星尾矩均数在死后6 h和12 h差异无统计学意义(P > 0.05),24 h和36 h彗星尾矩均数差异有显著性(P < 0.05);尾DNA均数在6 h,12 h,24 h三个时间点差异无显著性(P > 0.05),但与36 h,48 h尾DNA均数的差异均有显著性(P < 0.05)&#65377;【结论】 SD大鼠肾脏细胞DNA降解随死亡时间延长而增加,彗星试验技术为死亡时间推断提供了重要的实验依据&#65377;     

重组腺相关病毒介导caveolin-1基因表达抑制肝癌新生血管形成的实验研究

目的 探讨caveolin-1参与肝细胞癌血管生成及影响血管通透性的作用机制.方法 构建肝癌细胞系HepG2裸鼠皮下移植瘤模型,局部注射编码重组可溶性caveolin-1蛋白的重组腺相关病毒载体rAAV-PEG-caveolin-1,观察其对肝癌细胞生长的抑制作用;通过肿瘤微血管密度(microvessel density,MVD)检测肿瘤新生血管的生成;Western blot检测脉管标志蛋白PECAM-1表达改变;FITC标记右旋糖苷测定肿瘤微血管通透性;放射强度测定法检测肝癌组织中eNOS活性,TUNEL法检测caveolin-1对肿瘤细胞的诱导凋亡效应.结果 rAAV-PEG-caveolin-1转染组治疗第14天后,移植瘤的瘤重较对照组和空载体转染组有不同程度的减小(P＜O.05);免疫组化分析及Western blot结果显示rAAV-PEG-caveolin-1转染组较对照组及空载体组MVD及PECAM-1表达显著减少(P＜0.05);FITC-右旋糖苷测定表明rAAV-PEG-caveolin-1可有效降低肿瘤微血管通透性;rAAV-PEG-caveolin-1转染组较对照组及空载体组eNOS活性明显下降(P＜0.05);TUNEL分析显示rAAV-PEG-caveolin-1可诱导肿瘤细胞凋亡.结论 Caveolin-1是血管生成调节的关键分子,能显著抑制肿瘤新生血管的形成,并能有效降低肿瘤微血管的通透性.

Abstract：

Objective To investigate the antitumor effect of the recombined adeno-associated virus encoding caveolin-1 regulated by progression-elevated gene (PEG) promotor on the angiogenesis of implanted human hepatocellular carcinoma(HCC) cell lines in a nude mouse model. Methods HepG2 cells were inoculated subcutaneously into NOD/SCID mice, and animals were treated with rAAV-PEG-caveolin-1 after tumor cell innoculation. The fluorescence ratio of Evans blue to FITC-dextran was used to assess the changes of microvasculature permeability of the tumor. Western blot and immunohistochemical analyses were employed to detect PECAM-1 expression in tumor microvascular endothelium and microvessel density(MVD), respectively; NOS activity was assessed by citrulline generation. Tumor growth was observed and tumor cell apoptosis in tumor tissues were measured by TUNEL. Results Tumor growth was significantly inhibited in mice injected with rAAV-PEG-caveolin-1. The administration of rAAV-PEG-caveolin-1 significantly blocked vascular leakage in the tumor microcirculation. The levels of PECAM-1 protein detected by Western blot were markedly reduced in rAAV-PEG-caveolin-1-treated mice, and there were fewer MVD in tumors from caveolin-1-treated mice, while NOS catalytic activity was much lower in rAAV-PEG-caveolin-1-treated mice compared to the control and empty vector-treated animals. TUNEL demonstrated significant induction of tumor cell specific apoptosis. Conclusions rAAV-PEG-caveolin-1 can reduce tumor progression through blocking microvascular formation by inhibiting eNOS.